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    堿性磷酸酶標記試劑

    發(fā)布時間: 2011-10-19  點擊次數(shù): 2295次

    堿性磷酸酶標記試劑

    BCIP/NBT是堿性磷酸酶zui常使用的呈色底物,堿性磷酸酶標記的試劑應該用真核生物的堿性磷酸酶,因為這種酶容易被EDTA滅活。細菌酶難以終止其活性,易引起顯色過度,導致較高背景。
    BCIP/NBT底物在酶結(jié)合位點形成強烈的黑紫色沉淀,此反應是一個穩(wěn)定進行的過程。因此,可設定一個的反應對照。可以通過孵育時間的長短控制反應的敏感性。

    1.需要的溶液和特殊設備堿性磷酸酶標記試劑
    堿性磷酸酶緩沖液:100retool/L NaCl,5mmol/L MgCl2,100mmol/L Tris(pH9.5);
    NBT溶液(0.5gNBT用10ml 70%DMF溶解,貯存在4C);
    BCIP溶液(0.5gBCIP[二鈉鹽]用10m1100%DMF溶解,貯存在413);
    20mmol/LEDTA用PBS溶解,DPX。
    光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結(jié)果)
    堿性磷酸酶標記試劑
    2.操作步驟
    (1)細胞染色前,準備3種貯存液:①NBT:用10ml 70%DMF溶解0.5gNBT;②BCIP:用10ml 100%DMF溶解0.5g BCIP[二鈉鹽兒③堿性磷酸酶緩沖液:100mmol/LNaCl,5mmol/LMgCl2,100mmol/LTris(pH 9.5)。所有的貯存液置4C可保存1年。
    (2)實驗前,底物液新鮮配制。加66/ul NBT貯存液至10ml堿性磷酸酶緩沖液中,充分混合,加33ul BCIP貯存液,在1h內(nèi)使用。
    (3)將洗滌過的標本片放在一個適當?shù)娜萜鲀?nèi)。加足夠量的底物液覆蓋標本片(3~5ml適合于100mm平皿)。在室溫中進行反應直到染色達到適當黑色。對一些試劑可在顯微鏡下定期監(jiān)測。一般孵育時間大約是30min。
    (4)在含有20mmol/LEDTA的PBS中漂洗以終止反應,螯合Mg2+。
    (5)優(yōu)化:如果需要,進行復染。
    (6)用水沖洗,DPX封片。

     

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